03 Ιούλ Τα τεστ PCR)
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ή όπως έχει καθιερωθεί συντομογραφικά “PCR” (“Polymerase Chain Reaction”), αποτέλεσε τις τελευταίες δεκαετίες τη σπουδαιότερη και την πλέον αξιοποιημένη τεχνική πρόοδο στην μοριακή βιολογία. Στην τελική της μορφή περιγράφηκε το 1987 από τον Mullins και εφαρμόστηκε στη μελέτη του γενομικού υλικού των έμβιων όντων (του DNA).
Η αντίδραση στο εργαστήριο απομιμείται τον τρόπο με τον οποίο ειδικά ένζυμα του κυτταρικού πυρήνα αντιγράφουν το DNA για να το «διορθώσουν» όταν αυτό υποστεί βλάβες, ή -το κυριότερο- για να το διπλασιάσουν προκειμένου το κύτταρο να προχωρήσει στην μίτωση.
Ο σκελετός του DNA αποτελείται από δύο αλυσίδες σακχάρων που συνδέονται μεταξύ τους με φωσφορικά οξέα και διαπλέκονται στον χώρο σχηματίζοντας την περίφημη «διπλή έλικα». Η σύνδεση γίνεται με αυστηρά προκαθορισμένο τρόπο. Στη μία έλικα η θέση 5’ κάθε σακχάρου συνδέεται με τη θέση 3’ του επόμενου με την παρεμβολή ενός μορίου φωσφορικού οξέος, ενώ στην άλλη έλικα η σύνδεση είναι ανάποδη (η θέση 3’ με την θέση 5’), κ.ο.κ.
Κάθε σάκχαρο συνδέει σε άλλη θέση του μια αζωτούχο ένωση που αποκαλείται «πυρηνική βάση». Υπάρχουν δύο ζεύγη πυρηνικών βάσεων: οι πυριμιδίνες κυτοσίνη (C) και θυμίνη (Τ) και οι πουρίνες αδενίνη (Α) και γουανίνη (G). Αυτές οι πυρηνικές βάσεις περιέχουν την πληροφορία για την σειρά σύνδεσης των αμινοξέων στο κυτταρικό πρωτόπλασμα και συνεπώς για τη δομή των πρωτεϊνών που κάθε ομάδα πυρηνικών βάσεων κωδικοποιεί (δηλαδή τα γονίδια).
Η διάταξη των πυρηνικών βάσεων υπόκειται σε αυστηρή «συμπληρωματικότητα», τουτέστιν πάντα απέναντι σε μια αδενίνη τοποθετείται μια θυμίνη και πάντα μια κυτοσίνη συνδέεται με μια γουανίνη. Συνεπώς, όταν ένα μόριο μονόκλωνου DNA βρεθεί σε κατάλληλο περιβάλλον που περιέχει τις πυρηνικές βάσεις, τότε αυτές θα τοποθετηθούν απέναντι στις συμπληρωματικές τους βάσεις πάνω στο μονόκλωνο DNA-μήτρα και θα σχηματίσουν ένα κατοπτρικό αντίγραφο. Άρα η μία έλικα έχει δομή 5’-3’ και η άλλη 3’- 5’, εάν όμως η τελευταία διαβασθεί ανάποδα τότε η σειρά των βάσεων θα είναι ακριβώς ίδια με εκείνη της πρώτης (που χρησίμευσε ως «μήτρα»).
Η συρραφή της συμπληρωματικής έλικας γίνεται με τη βοήθεια ειδικών πυρηνικών ενζύμων, κυρίως της DNA-πολυμεράσης που αντιγράφει το μονόκλωνο DNA με κατεύθυνση 5’-3’, αρχίζοντας πάντα από την τοποθέτηση ενός φωσφορικού οξέος στη θέση 3’ του τελευταίου σακχάρου μιας δίκλωνης περιοχής.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης εφαρμόζεται για την παραγωγή σε πολλά αντίγραφα ειδικά επιλεγμένων αλληλουχιών DNA, με σκοπό την ενδελεχή μελέτη τους. Η αντίδραση γίνεται σε μονόκλωνο DNA. Για τον σκοπό αυτό το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται με θέρμανση (φάση 1, αποδιάταξη) και έπειτα σε κατάλληλες θέσεις του DNA που βρίσκονται από τη μία και από την άλλη πλευρά της περιοχής της οποίας επιθυμούμε την αντιγραφή, συνδέονται μικρά τμήματα DNA (20-30 νουκλεοτίδια) που συντίθενται τεχνητά στο εργαστήριο με δομή απόλυτα συμπληρωματική της αλληλουχίας με την οποία θα συνδεθούν (φάση 2, σύνδεση). Έτσι προκύπτει ένα δίκλωνο τμήμα DNA από την 3’ άκρη του οποίου η DNA πολυμεράση αρχίζει την αντιγραφή. Τα τεχνητά τμήματα DNA ονομάζονται «εκκινητές» (“primers”). Τέλος στο διάλυμα προστίθενται τα 4 νουκλεοτίδια και η κατάλληλη πολυμεράση που αντιγράφει με κατεύθυνση 5’-3’ την προεπιλεγμένη περιοχή της έλικας-μήτρας σχηματίζοντας το κατοπτρικό της αντίγραφο, το οποίο συνδέεται με την έλικα-μήτρα αποτελώντας ένα «ημι-τεχνητό» δίκλωνο DNA (φάση 3, αντιγραφή).
Ο κύκλος ξαναρχίζει με την αποδιάταξη του νεοσυσταθέντος DNA και επανάληψη των φάσεων 2 και 3, οπότε τα 2 αντίγραφα του πρώτου κύκλου γίνονται 4, τα 4 του δεύτερου κύκλου 8, κ.ο.κ., μέχρις ότου στο τέλος των 30 κύκλων που γίνονται συνήθως, τα αντίγραφα να είναι 230. Το ποσό αυτό ανιχνεύεται με ηλεκτροφόρηση και προσφέρεται για μελέτες δομής και λειτουργίας.
Το προϊόν της αντίδρασης PCR συμβάλλει στην ανίχνευση φυσιολογικών η παθολογικών γονιδίων σε πάμπολλα γενετικά νοσήματα, στην ανίχνευση υπολειμματικής νόσου (σε ύφεση), στην ανίχνευση ανθρωπολογικών χαρακτήρων η παθολογικών γονιδίων σε παλαιούς ιστούς, σε πτωματικό υλικό, ή και στο ελάχιστο υλικό που διατίθεται μετά από εγκληματικές ενέργειες (τρίχες, σπέρμα, αίμα -γενετικό αποτύπωμα). Η PCR έχει επίσης άπειρες εφαρμογές στην γενετική μηχανική, καθώς και στην ανίχνευση και τυποποίηση μικροβίων, ιών και άλλων μικροοργανισμών. Πρόσφατα, η PCR βρήκε εφαρμογή στην ανίχνευση ιικών σωματιδίων του SARS-CoV-2. H θετικότητα του τεστ προϋποθέτει την ανίχνευση ενός ορισμένου αριθμού ιικών σωματιδίων. Το τεστ προσδιορίζει μόνο αντιγόνο (αν κάποιος έχει προσβληθεί από τον ιό), όχι αντισώματα (αν κάποιος νόσησε στο παρελθόν), και έχει ειδικότητα 100% και ευαισθησία 99.2%.